Glycocalyx: Definisi, Sejarah, Komposisi, Lokasi dan Teknik Visualisasi

Glycocalyx: Definisi, Sejarah, Komposisi, Lokasi dan Teknik Visualisasi

Sebagian besar sel epitel hewan memiliki lapisan seperti bulu di permukaan luar membran plasmanya.

Glycocalyx, juga dikenal sebagai matriks periseluler, adalah penutup glikoprotein dan glikolipid yang mengelilingi membran sel beberapa bakteri, epitel, dan sel lainnya.

Lapisan ini terdiri dari berbagai bagian karbohidrat dari glikolipid membran dan glikoprotein, yang berfungsi sebagai molekul tulang punggung untuk penopang.

Secara umum, bagian karbohidrat dari glikolipid yang ditemukan pada permukaan membran plasma membantu molekul-molekul ini berkontribusi pada pengenalan sel, komunikasi, dan adhesi antar sel.

Glycocalyx adalah jenis pengenal yang digunakan tubuh untuk membedakan antara sel sehatnya sendiri dan jaringan yang ditransplantasikan, sel yang sakit, atau organisme yang menyerang.

Termasuk dalam glikokaliks adalah molekul adhesi sel yang memungkinkan sel untuk saling menempel dan memandu pergerakan sel selama perkembangan embrionik.

Glikokaliks memainkan peran utama dalam regulasi jaringan endotel vaskular, termasuk memodulasi volume sel darah merah di kapiler.

Lumpur di bagian luar ikan adalah contoh glikokaliks. Istilah ini awalnya diterapkan pada matriks polisakarida yang melapisi sel-sel epitel, tetapi fungsinya telah ditemukan lebih jauh.

Sejarah

Glikokaliks endotel sudah divisualisasikan sekitar 40 tahun yang lalu oleh Luft menggunakan mikroskop elektron. Namun, relatif sedikit yang diketahui tentang komposisi dan fungsi lapisan ini.

Dalam beberapa dekade terakhir, telah semakin dihargai sebagai faktor penting dalam fisiologi dan patologi vaskular, seperti yang dijelaskan pada tahun 2000 dalam ulasan oleh Pries et al. dan di ulasan lain yang lebih baru.

Ketertarikan pada peran fisiologis (patho) glikokaliks dimulai dengan pengamatan hematokrit tabung kapiler yang rendah dan bervariasi, yang tergantung pada tingkat aktivasi metabolik dan farmakologis dari sistem vaskular.

Hubungan antara metabolisme dan peningkatan kecepatan sel darah merah yang diinduksi agonis, di satu sisi, dan hematokrit, di sisi lain, sebagian dapat dijelaskan oleh skimming plasma sebagai kelanjutan langsung dari efek Fåhraeus.

Namun, hubungan ini dipisahkan dari pengobatan lokal pembuluh mikro dengan heparinase, enzim yang memecah sulfat heparan dalam glikokaliks.

Temuan ini sesuai dengan perkiraan teoretis yang memprediksi lapisan plasma 1,2 m yang bergerak lambat pada endotelium.

Studi in vivo telah mengungkapkan bahwa glikokaliks di kapiler otot adalah lapisan setebal kira-kira 0,5 m, yang menutupi sel endotel dan menentukan domain luminal untuk makromolekul, sel darah merah dan putih.

Studi yang lebih baru menunjukkan bahwa ketebalan glikokaliks meningkat dengan diameter vaskular, setidaknya dalam sistem arteri, yang bervariasi dari 2 hingga 3 m di arteri kecil hingga 4,5 m di arteri karotis.

Sampai saat ini, banyak penelitian menunjukkan berbagai fungsi fisiologis (patho) untuk glikokaliks endotel; Selain memodulasi pengisian kapiler sel darah merah, glikokaliks dapat mempengaruhi banyak fungsi lain dari sistem vaskular.

Sementara endotel vaskular saat ini diyakini terlibat secara aktif “dalam setiap patologi yang menyajikan proyeksi vaskular,” pepatah yang sama mungkin benar untuk glikokaliks.

Menilai kemungkinan keterlibatan glikokaliks endotel ini memerlukan visualisasi yang andal dari lapisan halus ini, yang merupakan tantangan besar.

Komposisi

Glikokaliks endotel adalah lapisan kaya karbohidrat yang melapisi endotel vaskular. Itu dianggap terhubung ke endotelium melalui beberapa molekul “utama”, terutama proteoglikan dan juga glikoprotein.

Ini membentuk jaringan di mana molekul larut yang berasal dari plasma atau endotelium tergabung.

Lebih luminal, glikokaliks terdiri dari komponen larut plasma, dihubungkan bersama-sama secara langsung atau oleh proteoglikan larut dan / atau glikosaminoglikan.

Ada keseimbangan dinamis antara lapisan komponen terlarut ini dan darah yang mengalir, yang terus menerus mempengaruhi komposisi dan ketebalan glikokaliks.

Selain itu, glikokaliks menderita pelepasan enzimatik atau yang diinduksi geser. Keseimbangan dinamis antara biosintesis dan pelepasan membuat sulit untuk mendefinisikan glikokaliks secara geometris.

Komposisi mesh proteoglikan terikat membran, glikoprotein dan glikosaminoglikan dan komposisi protein plasma terkait dan glikosaminoglikan terlarut tidak dapat dilihat sebagai gambar statis.

Sebaliknya, lapisan secara keseluruhan, juga dikenal sebagai lapisan permukaan endotel (ESL), sangat dinamis, dengan molekul terikat membran yang terus-menerus diganti dan tanpa batas yang pasti antara unsur dan asosiasi yang disintesis secara lokal.

Hyaluronan yang terikat membran dapat mencapai panjang > 1 m.

Teknik visualisasi langsung tidak menunjukkan perbedaan komposisi yang jelas dalam glikokaliks, dari membran endotel ke lumen vaskular, tetapi lebih menunjukkan bahwa glikokaliks endotel menyerupai jaringan rakitan 3D yang rumit dari berbagai polisakarida.

Penghapusan enzimatik dari salah satu komponennya secara dramatis mempengaruhi sifat glikokaliks, mencontohkan pentingnya mempertimbangkan interaksi sinergis dari semua konstituen glikokaliks secara keseluruhan.

Lokasi

Dalam jaringan endotel pembuluh darah

Glikokaliks ditemukan pada permukaan apikal sel endotel pembuluh darah yang melapisi lumen.

Ketika pembuluh diwarnai dengan pewarna kationik, seperti biru Alcian, mikroskop elektron transmisi menunjukkan lapisan kecil berbentuk tidak beraturan yang memanjang sekitar 50-100 nm dalam cahaya pembuluh darah.

Studi lain menggunakan mikroskop elektron cryotransmission dan menunjukkan bahwa glikokaliks endotel dapat mencapai ketebalan 11 m. Ini hadir dalam berbagai tempat tidur mikrovaskular (kapiler) dan pembuluh darah makro (arteri dan vena).

Glycocalyx juga terdiri dari berbagai macam enzim dan protein yang mengatur adhesi leukosit dan trombosit, karena peran utamanya dalam pembuluh darah adalah untuk mempertahankan homeostasis plasma dan dinding pembuluh darah. Enzim dan protein ini meliputi:

Sintesis oksida nitrat endotel (SON endotel).

Superoksida dismutase ekstraseluler (SDE3).

Enzim pengubah angiotensin.

Antitrombin III.

Lipoprotein lipase.

Apolipoprotein.

Faktor pertumbuhan.

Kemokin.

Enzim dan protein yang tercantum di atas berfungsi untuk memperkuat penghalang glikokaliks terhadap penyakit pembuluh darah dan penyakit lainnya.

Fungsi utama lain dari glikokaliks dalam endotel vaskular adalah melindungi dinding vaskular dari paparan langsung aliran darah, sekaligus berfungsi sebagai penghalang permeabilitas vaskular.

Fungsi pelindungnya bersifat universal di seluruh sistem vaskular, tetapi kepentingan relatifnya bervariasi tergantung pada lokasi tepatnya di pembuluh darah.

Pada jaringan mikrovaskuler, glikokaliks berfungsi sebagai penghalang permeabilitas pembuluh darah dengan menghambat pembekuan dan adhesi leukosit.

Leukosit tidak boleh menempel pada dinding pembuluh darah karena merupakan komponen penting dari sistem kekebalan yang harus dapat melakukan perjalanan ke bagian tubuh tertentu saat dibutuhkan.

Dalam jaringan pembuluh darah arteri, glikokaliks juga menghambat pembekuan dan adhesi leukosit, tetapi melalui mediasi pelepasan oksida nitrat yang diinduksi oleh tegangan geser.

Fungsi pelindung lain di seluruh sistem kardiovaskular adalah kemampuannya untuk mempengaruhi filtrasi cairan interstisial dari kapiler ke dalam ruang interstisial.

Glikokaliks, ditemukan pada permukaan apikal sel endotel, terdiri dari jaringan bermuatan negatif dari proteoglikan, glikoprotein, dan glikolipid.

Dalam bakteri dan alam

Glikokaliks, yang secara harfiah berarti “lapisan gula”, adalah jaringan polisakarida yang menonjol dari permukaan sel bakteri, mengklasifikasikannya sebagai komponen permukaan universal sel bakteri, yang terletak tepat di luar dinding bakteri.

Glikokaliks agar-agar yang berbeda disebut kapsul, sedangkan lapisan yang menyebar dan tidak beraturan disebut lapisan lendir. Mantel ini sangat terhidrasi dan diwarnai merah rutenium.

Bakteri yang tumbuh di ekosistem alami, seperti di tanah, usus sapi atau saluran kemih manusia, dikelilingi oleh semacam mikrokoloni yang tertutup glikokaliks.

Ini berfungsi untuk melindungi bakteri dari fagosit berbahaya dengan membuat kapsul atau membiarkan bakteri menempel pada permukaan lembam, seperti gigi atau batu, melalui biofilm.

Sebagai contoh, Streptococcus pneumoniae menempel pada sel paru-paru, prokariota, atau bakteri lain yang dapat menggabungkan glikokalisesnya untuk menyelimuti koloni.

Di saluran pencernaan

Glikokaliks juga dapat ditemukan di bagian apikal mikrovili di dalam saluran pencernaan, terutama di dalam usus kecil.

Ini menciptakan jaringan setebal 0,3 m dan terdiri dari mukopolisakarida asam dan glikoprotein yang menonjol dari membran plasma apikal sel epitel penyerap.

Ini menyediakan area permukaan tambahan untuk adsorpsi dan termasuk enzim yang disekresikan oleh sel-sel penyerapan yang penting untuk langkah akhir pencernaan protein dan gula.

Fungsi umum lainnya

Perlindungan : melindungi membran plasma dan melindunginya dari kerusakan kimia.

Kekebalan terhadap infeksi : memungkinkan sistem kekebalan untuk secara selektif mengenali dan menyerang organisme asing.

Pertahanan kanker : Perubahan glikokaliks sel kanker memungkinkan sistem kekebalan mengenali dan menghancurkannya.

Kompatibilitas Transplantasi – membentuk dasar untuk kompatibilitas transfusi darah, cangkok jaringan, dan transplantasi organ.

Adhesi sel : menyatukan sel-sel agar jaringan tidak hancur.

Regulasi inflamasi : Lapisan glikokaliks pada dinding endotel pembuluh darah mencegah leukosit berguling atau bergabung menjadi keadaan sehat.

Fertilisasi : memungkinkan sperma mengenali dan mengikat sel telur.

Perkembangan embrio : mengarahkan sel-sel embrionik ke tujuan mereka di dalam tubuh.

Teknik visualisasi

Karena pentingnya fungsi glikokaliks endotel, pengembangan teknik visualisasi langsung sangat penting untuk menetapkan fungsi pastinya.

Glycocalyx dapat diberi label dengan memberikan penanda khusus yang mengikat satu atau lebih komponennya, membuatnya berpendar atau dapat dideteksi.

Persiapan (bagian dari) kapal kemudian akan memungkinkan untuk mendapatkan gambar mikroskopis spesifik dari glikokaliks endotel.

Sayangnya, glycocalyx sangat rentan dan mudah terganggu atau dehidrasi selama penanganan kapal dan protokol persiapan.

Akibatnya, dimensi glikokaliks mudah diremehkan, yang diilustrasikan oleh gambar pertama glikokaliks, yang dibuat dengan mikroskop elektron transmisi (MET) pada tahun 1966 menggunakan probe merah rutenium.

Ketebalan glikokaliks yang diukur dengan cara ini mendekati 20 nm di kapiler. Sejak itu, banyak upaya lain telah dilakukan untuk menggambarkan glikokaliks menggunakan mikroskop elektron transmisi.

Dalam sel endotel aorta sapi di bawah kondisi geser 3,0 Pa, glikokaliks dilaporkan setebal 40 nm.

Dimensi ini tidak memenuhi perkiraan teoretis yang memprediksi glikokaliks hingga setebal 1 m.

Menggunakan protokol pewarnaan baru dengan Alcian blue 8GX, van den Berg et al. Mikroskop elektron transmisi baru-baru ini diterapkan untuk mengukur dimensi glikokaliks endotel di kapiler miokard tikus.

Studi ini mengungkapkan bahwa sel-sel endotel ditutupi oleh glikokaliks setebal 200 hingga 500 nm.

Perawatan Hyaluronidase sebelum fiksasi dan pewarnaan menghasilkan pengurangan yang signifikan dari lapisan ini pada 100-200 nm.

Kelompok Haraldsson dan Rostgaard dan Qvortrup meningkatkan protokol pewarnaan mikroskop elektron transmisi menggunakan fiksatif oksigen berbasis fluorokarbon, mengungkapkan glikokaliks setebal 60-200 nm di kapiler glomerulus dan 50-100 nm di kapiler berfenestrasi usus. .

Pewarnaan baru dan protokol persiapan tampaknya meningkatkan pelestarian glikokaliks dalam percobaan mikroskop elektron transmisi. Namun, mikroskop elektron transmisi tidak dapat digunakan dalam situasi in vivo.

Sekitar 30 tahun setelah gambar mikroskop elektron transmisi pertama dibuat, Vink et al. menggunakan mikroskop intravital untuk memvisualisasikan glikokaliks endotel di kapiler otot hamster cremaster in vivo menggunakan pendekatan tidak langsung.

Glycocalyx diakui sebagai “zona eksklusi” atau “celah” antara sel darah merah yang mengalir dan endotelium. Selanjutnya, plasma diberi label dengan dekstran fluoresen, dan glikokaliks kemudian muncul sebagai zona eksklusi plasma.

Menariknya, tidak ada zona eksklusi yang ditemukan untuk sel darah putih, menunjukkan bahwa mereka memiliki kemampuan untuk mengompresi glikokaliks di pembuluh ini, sesuai dengan perkiraan kekakuan glikokaliks yang rendah.

Pengurangan diameter kolom plasma dari diameter internal anatomi mengungkapkan dimensi glikokaliks, yang tampaknya setebal 0,4-0,5 m.

Metode ini telah digunakan dalam banyak penelitian sejak saat itu, terutama pada mikroperedaran otot kremaster hamster atau tikus.

Jaringan ini cocok untuk mikroskop intravital karena tipis dan tembus cahaya, memungkinkan visualisasi yang jelas dari sel-sel endotel mikrovaskular dan sel darah, dengan gerakan dinding pembuluh yang rendah atau tidak ada sama sekali.

Selain itu, kecepatan aliran lokal dapat diukur. Namun, estimasi ketebalan glikokaliks menggunakan metode berdasarkan mikroskop intravital tidak langsung. Selanjutnya, mikroskop intravital tidak dapat diterapkan pada gambar glikokaliks endotel di pembuluh darah yang lebih besar.

Visualisasi langsung glikokaliks telah dicapai melalui beberapa pendekatan, sebagian besar menggunakan lektin yang merupakan protein yang mengikat residu disakarida spesifik dari rantai glikosaminoglikan.

Tag lainnya termasuk antibodi terhadap heparan sulfat, syndecane-1, atau hyaluronan. Dengan mengikat penanda ini ke probe fluoresen, teknik mikroskopis canggih dapat diterapkan untuk memvisualisasikan glikokaliks.

Mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) memungkinkan pemotongan optik dengan resolusi optik yang baik, memungkinkan rekonstruksi 3D sampel.

Pelabelan lektin dari glikokaliks sel endotel vena umbilikalis manusia yang dikultur dan pencitraan mikroskop pemindaian laser confocal berikutnya mengungkapkan lapisan permukaan setebal 2,5 ± 0,5 m.

Mikroskop pemindaian laser confocal juga telah digunakan untuk mendeteksi perubahan konsentrasi lektin berlabel fluoresensi dalam glikokaliks venula pascakapiler mesenterium tikus tetap pada iskemia / reperfusi dan peradangan.

Karena pembuluh yang lebih besar memiliki dinding yang lebih tebal, menghasilkan penetrasi cahaya yang lebih dalam dengan kehilangan resolusi yang signifikan pada kedalaman yang lebih besar (> 40 m).

Karena dispersi sinyal yang lebih besar, mikroskop pemindaian laser confocal kurang cocok untuk pencitraan glikokaliks di arteri.

Teknik yang menjanjikan untuk secara langsung memvisualisasikan glikokaliks dalam pembuluh yang lebih besar, baik ex vivo maupun in vivo, adalah mikroskop pemindaian laser dua foton (TPLSM).

Mikroskop pemindaian laser dua foton bergantung pada eksitasi fluorofor dengan pengambilan simultan (yaitu, dalam 10-18 detik) dari dua foton merah, daripada satu foton biru seperti pada eksitasi fluoresensi konvensional.

Penggunaan foton merah panjang gelombang panjang mengurangi hamburan dan karena itu meningkatkan kedalaman penetrasi ke dalam jaringan.

Eksitasi fluorofor dan fluoresensi konsekuen hanya terjadi pada titik fokus kerucut iluminasi, karena probabilitas eksitasi dua foton bergantung pada kuadrat intensitas foton eksitasi.

Setiap cahaya yang diterima oleh photomultiplier harus berasal dari posisi fokus, sehingga hamburan foton yang dipancarkan tidak mempengaruhi resolusi dan tidak diperlukan pitting.

Akibatnya, mikroskop pemindaian laser dua foton menawarkan resolusi yang baik dan penampang optik pada kecepatan akuisisi yang wajar, sedangkan pemutihan dan fototoksisitas pewarna terbatas pada posisi fokus.

Kombinasi kedalaman penetrasi yang ditingkatkan, resolusi yang baik, pemotongan optik, dan fototoksisitas rendah membuat mikroskop pemindaian laser dua foton menjadi teknik yang cocok untuk memvisualisasikan glikokaliks endotel yang halus dalam pembuluh yang lebih besar.

Ide ini dikonfirmasi oleh penelitian terbaru oleh Megens dan rekan di mana glikokaliks endotel dicitrakan dengan mikroskop pemindaian laser dua foton pada arteri karotis tikus yang utuh; ketebalan glikokaliks adalah 4,5 ± 1,0 m.

Karena mikroskop pemindaian laser dua foton juga diterapkan in vivo pada hewan pengerat, ini bisa menjadi pendekatan yang baik untuk visualisasi glikokaliks in vivo dalam makroperedaran hewan-hewan ini.

Kesimpulan.

Pada endotel vaskular, glikokaliks adalah anyaman terikat membran di mana molekul-molekul turunan plasma terintegrasi.

Ia melakukan berbagai fungsi, penting dalam fisiologi vaskular normal dan juga pada penyakit vaskular.

Meskipun data dari percobaan di mikroperedaran dan, baru-baru ini, makroperedaran sangat menyarankan peran vaskuloprotektif untuk glikokaliks, penelitian tentang topik ini terhambat oleh kurangnya teknik visualisasi yang baik.

Mikroskop laser dua foton dapat menjadi alat yang berhasil untuk mencapai visualisasi langsung glikokaliks di arteri yang lebih besar pada hewan pengerat, baik ex vivo maupun in vivo, dengan kemungkinan menganalisis variasi fokus dalam komposisi atau integritas lapisan ini.