Plasmid: Pengertian, Sejarah, Sifat, Ciri, Klasifikasi, Jenis dan Ekstraksi DNA Plasmid

Plasmid: Pengertian, Sejarah, Sifat, Ciri, Klasifikasi, Jenis dan Ekstraksi DNA Plasmid

Ini adalah molekul DNA kecil di dalam sel yang secara fisik terpisah dari DNA kromosom dan dapat bereplikasi secara independen.

Mereka umumnya ditemukan sebagai molekul DNA untai ganda melingkar kecil pada bakteri; Namun, plasmid kadang-kadang ada di archaea dan organisme eukariotik .

Di alam, plasmid sering membawa gen yang dapat bermanfaat bagi kelangsungan hidup organisme, misalnya resistensi terhadap antibiotik.

Meskipun kromosom berukuran besar dan mengandung semua informasi genetik penting untuk hidup dalam kondisi normal, plasmid biasanya sangat kecil dan hanya mengandung gen tambahan yang mungkin berguna bagi tubuh dalam situasi atau kondisi tertentu.

Plasmid buatan banyak digunakan sebagai vektor dalam kloning molekuler, yang berfungsi untuk mendorong replikasi sekuens DNA rekombinan dalam organisme inang.

Di laboratorium, plasmid dapat dimasukkan ke dalam sel melalui transformasi.

Plasmid dianggap sebagai replika, unit DNA yang mampu mereplikasi secara mandiri dalam inang yang sesuai. Namun, plasmid, seperti virus, umumnya tidak diklasifikasikan.

Plasmid ditransmisikan dari satu bakteri ke bakteri lain (bahkan spesies lain) terutama melalui konjugasi.

Transfer materi genetik dari inang ke inang adalah mekanisme transfer gen horizontal, dan plasmid dianggap sebagai bagian dari mobilom.

Tidak seperti virus (yang melapisi materi genetiknya dalam lapisan protein pelindung yang disebut kapsid), plasmid adalah DNA “telanjang” dan tidak mengkodekan gen yang diperlukan untuk merangkum materi genetik dan mentransfernya ke inang baru.

Namun, beberapa kelas plasmid mengkodekan pilus konjugatif “seksual” yang diperlukan untuk transfer mereka sendiri. Ukuran plasmid berkisar dari 1 hingga lebih dari 200 kbp, dan jumlah plasmid identik dalam satu sel dapat berkisar dari satu hingga ribuan dalam beberapa keadaan.

Hubungan antara mikroba dan DNA plasmid bukanlah parasit atau mutualistik, karena masing-masing menyiratkan adanya spesies independen yang hidup dalam keadaan merugikan atau komensal dengan organisme inang.

Sebaliknya, plasmid menyediakan mekanisme untuk transfer gen horizontal dalam populasi mikroba dan biasanya memberikan keuntungan selektif dalam keadaan lingkungan tertentu.

Plasmid dapat membawa gen yang memberikan resistensi terhadap antibiotik alami dalam ceruk ekologi yang kompetitif.

Entah protein yang dihasilkan dapat bertindak sebagai racun dalam keadaan yang sama, atau mereka memungkinkan tubuh untuk menggunakan senyawa organik tertentu yang akan menguntungkan ketika nutrisi kekurangan pasokan.

Sejarah

Istilah plasmid diperkenalkan pada tahun 1952 oleh ahli biologi molekuler Amerika Joshua Lederberg untuk merujuk pada “setiap penentu warisan ekstrakromosomal.”

Istilah ini mencakup materi genetik bakteri apa pun yang ada secara ekstrakromosom selama setidaknya sebagian dari siklus replikasinya.

Tetapi karena deskripsi itu mencakup virus bakteri, gagasan plasmid disempurnakan dari waktu ke waktu untuk memahami unsur genetik yang bereproduksi secara mandiri.

Kemudian, pada tahun 1968, diputuskan bahwa istilah plasmid harus diadopsi sebagai istilah untuk unsur genetik ekstrakromosom, dan untuk membedakannya dari virus, definisi tersebut dipersempit menjadi unsur genetik yang ada secara eksklusif atau dominan di luar kromosom dan dapat bereplikasi begitu otonom.

Properti dan karakteristik

Agar plasmid dapat bereplikasi secara independen di dalam sel, mereka harus memiliki rangkaian DNA yang dapat bertindak sebagai tempat asal replikasi. Unit yang menggandakan diri, dalam hal ini plasmid, disebut replika.

Replika bakteri yang khas dapat terdiri dari sejumlah unsur, seperti gen untuk protein inisiasi replikasi spesifik plasmid (Rep), unit berulang yang disebut iteron, kotak DnaA, dan daerah kaya AT yang berdekatan.

Plasmid yang lebih kecil menggunakan enzim replikasi inang untuk membuat salinan dari dirinya sendiri, sedangkan plasmid yang lebih besar dapat membawa gen spesifik untuk replikasi plasmid tersebut.

Beberapa jenis plasmid juga dapat menyisipkan ke dalam kromosom inang, dan plasmid yang terintegrasi ini kadang-kadang disebut episom pada prokariota.

Plasmid hampir selalu membawa setidaknya satu gen. Banyak gen yang dibawa oleh plasmid bermanfaat bagi sel inang, misalnya:

Mereka memungkinkan sel inang untuk bertahan hidup di lingkungan yang sebaliknya akan mematikan atau membatasi pertumbuhan.

Beberapa gen ini mengkodekan sifat resistensi terhadap antibiotik atau resistensi terhadap logam berat.

Sementara yang lain dapat menghasilkan faktor virulensi yang memungkinkan bakteri menjajah inang dan mengatasi pertahanannya.

Atau mereka memiliki fungsi metabolisme spesifik yang memungkinkan bakteri memanfaatkan nutrisi tertentu, termasuk kemampuan untuk memecah senyawa organik yang bandel atau beracun.

Plasmid juga dapat memberikan bakteri kemampuan untuk memperbaiki nitrogen.

Namun, beberapa plasmid tidak memiliki efek yang dapat diamati pada fenotipe sel inang atau manfaatnya bagi sel inang tidak dapat ditentukan, dan plasmid ini disebut plasmid samar.

Plasmid yang terjadi secara alami sangat bervariasi dalam sifat fisiknya. Ukurannya dapat berkisar dari plasmid mini yang sangat kecil kurang dari 1 pasangan kilobasa (Kbp) hingga megaplasmid yang sangat besar dengan beberapa pasangan megabasa (Mbp).

Pada akhir yang tinggi, sedikit yang dapat membedakan antara megaplasmid dan minichromosome.

Plasmid umumnya berbentuk lingkaran; namun, contoh plasmid linier juga diketahui. Plasmid linier ini memerlukan mekanisme khusus untuk mereplikasi ujungnya.

Plasmid dapat hadir dalam satu sel dalam jumlah yang bervariasi, mulai dari satu hingga beberapa ratus.

Jumlah normal salinan plasmid yang dapat ditemukan dalam satu sel disebut nomor salinan dan ditentukan oleh bagaimana inisiasi replikasi diatur dan ukuran molekul.

Plasmid yang lebih besar cenderung memiliki jumlah salinan yang lebih rendah.

Plasmid salinan tunggal semacam itu memiliki sistem yang secara aktif berusaha mengirimkan satu salinan ke kedua sel anak. Sistem ini, yang meliputi sistem parABS dan sistem parMRC, sering disebut sebagai sistem partisi atau fungsi partisi plasmid.

Klasifikasi dan jenis

Plasmid dapat diklasifikasikan dalam beberapa cara. Plasmid dapat secara luas diklasifikasikan menjadi plasmid konjugatif dan plasmid non-konjugatif.

Plasmid konjugatif mengandung satu set gen transfer atau TRA yang mempromosikan konjugasi seksual antara sel yang berbeda.

Dalam proses konjugasi yang kompleks, plasmid dapat ditransfer dari satu bakteri ke bakteri lain melalui pili seksual yang dikodekan oleh beberapa gen TRA.

Plasmid non-konjugatif tidak dapat memulai konjugasi, oleh karena itu mereka hanya dapat ditransfer dengan bantuan plasmid konjugatif.

Plasmid kelas menengah dapat dimobilisasi dan hanya membawa sebagian gen yang diperlukan untuk transfer.

Plasmid juga dapat diklasifikasikan ke dalam kelompok inkompatibilitas. Suatu mikroba dapat menampung berbagai jenis plasmid, namun, plasmid yang berbeda hanya dapat ada dalam satu sel bakteri jika mereka kompatibel.

Jika dua plasmid tidak kompatibel, satu atau yang lain akan dengan cepat hilang dari sel. Oleh karena itu, plasmid yang berbeda dapat ditempatkan pada kelompok ketidakcocokan yang berbeda tergantung pada apakah mereka dapat hidup berdampingan.

Plasmid yang tidak kompatibel (milik kelompok ketidakcocokan yang sama) biasanya berbagi mekanisme replikasi atau partisi yang sama dan karena itu tidak dapat disimpan bersama dalam satu sel.

Cara lain untuk mengklasifikasikan plasmid adalah dengan fungsi:

Fertilitas F-plasmid : mengandung gen TRA. Mereka mampu berkonjugasi dan menghasilkan ekspresi pili seksual.

Plasmid kubis : yang mengandung gen yang mengkode bakteriosin, protein yang dapat membunuh bakteri lain.

Plasmid degradatif : yang memungkinkan pencernaan zat yang tidak biasa, misalnya. toluena dan asam salisilat.

vektor kartun

Plasmid yang dibuat secara artifisial dapat digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Berbagai macam plasmid tersedia secara komersial untuk penggunaan tersebut.

Gen yang akan direplikasi biasanya dimasukkan ke dalam plasmid yang biasanya berisi sejumlah karakteristik untuk digunakan.

Ini termasuk gen yang memberikan resistensi terhadap antibiotik tertentu (ampisilin paling sering digunakan untuk strain bakteri).

Asal replikasi untuk memungkinkan sel bakteri mereplikasi DNA plasmid dan situs yang cocok untuk kloning (disebut situs kloning ganda).

Kloning

Plasmid adalah vektor kloning bakteri yang paling umum digunakan.

Vektor kloning ini berisi situs yang memungkinkan penyisipan fragmen DNA, misalnya, situs kloning ganda atau polilinker yang memiliki beberapa situs restriksi yang umum digunakan untuk mengikat fragmen DNA.

Plasmid ini mengandung penanda yang dapat dipilih, umumnya gen resistensi antibiotik, yang memberikan kemampuan bakteri untuk bertahan hidup dan berkembang biak dalam media pertumbuhan selektif yang mengandung antibiotik tertentu.

Sel setelah transformasi diekspos ke media selektif, dan hanya sel yang mengandung plasmid yang dapat bertahan.

Dengan cara ini, antibiotik bertindak sebagai filter untuk memilih hanya bakteri yang mengandung DNA plasmid.

Vektor juga dapat mengandung gen penanda lain atau gen reporter untuk memfasilitasi pemilihan plasmid dengan sisipan kloning.

Bakteri yang mengandung plasmid kemudian dapat dibiakkan dalam jumlah besar, dipanen, dan plasmid yang diinginkan kemudian dapat diisolasi menggunakan berbagai metode preparasi plasmid.

Vektor kloning plasmid biasanya digunakan untuk mengkloning fragmen DNA hingga 15 kbp.

Untuk mengkloning DNA yang lebih panjang, fag lambda dengan gen lisogeni, kosmid, kromosom buatan bakteri, atau kromosom buatan ragi dihapus.

Produksi protein

Penggunaan penting lainnya dari plasmid adalah untuk menghasilkan sejumlah besar protein.

Terapi gen

Plasmid juga dapat digunakan untuk transfer gen ke dalam sel manusia sebagai pengobatan potensial dalam terapi gen sehingga dapat mengekspresikan protein yang hilang dalam sel.

Beberapa strategi terapi gen memerlukan penyisipan gen terapeutik di situs target kromosom yang telah dipilih sebelumnya dalam genom manusia. Vektor plasmid adalah salah satu dari banyak pendekatan yang dapat digunakan untuk tujuan ini.

Nuklease jari seng (ZFNs) menawarkan cara untuk menyebabkan pemutusan untai ganda spesifik lokasi pada genom DNA dan menyebabkan rekombinasi homolog.

Plasmid yang mengkode nuklease jari seng dapat membantu mengirimkan gen terapeutik ke situs tertentu untuk menghindari kerusakan sel, mutasi penyebab kanker, atau respons imun.

Model penyakit

Plasmid secara historis digunakan untuk merekayasa genetika sel induk embrionik tikus untuk membuat caral penyakit genetik tikus.

Kemanjuran teknik berbasis plasmid yang terbatas menghalangi penggunaannya dalam menciptakan caral sel manusia yang lebih akurat.

Namun, kemajuan dalam teknik rekombinasi virus terkait adeno dan nuklease jari seng telah memungkinkan penciptaan generasi baru caral penyakit manusia isogenik.

Semua episode

Istilah episom diperkenalkan oleh François Jacob dan lie Wollman pada tahun 1958 untuk merujuk pada materi genetik ekstrakromosom yang dapat bereplikasi secara mandiri atau berintegrasi ke dalam kromosom.

Sejak istilah itu diperkenalkan, bagaimanapun, penggunaannya telah berubah karena plasmid telah menjadi istilah yang lebih disukai untuk replikasi otonom DNA ekstrakromosomal.

Pada simposium 1968 di London, beberapa peserta menyarankan untuk menghilangkan istilah episom, meskipun yang lain terus menggunakan istilah tersebut dengan perubahan makna.

Saat ini, beberapa penulis menggunakan episom dalam konteks prokariota untuk merujuk pada plasmid yang mampu berintegrasi ke dalam kromosom.

Mengintegrasikan plasmid dapat direplikasi dan dipertahankan secara stabil dalam sel melalui beberapa generasi, tetapi selalu pada tahap tertentu ada sebagai molekul plasmid yang terpisah.

Dalam konteks eukariota, istilah episom digunakan untuk merujuk pada molekul DNA sirkular ekstrakromosomal tertutup yang tidak terintegrasi yang dapat bereplikasi di dalam nukleus.

Virus adalah contoh paling umum dari ini, seperti virus herpes, adenovirus, dan poliomavirus, tetapi beberapa adalah plasmid.

Contoh lain termasuk fragmen kromosom yang menyimpang, seperti kromosom menit ganda, yang dapat muncul selama amplifikasi gen buatan atau dalam proses penyakit (misalnya, transformasi sel kanker).

Episom pada eukariota berperilaku mirip dengan plasmid pada prokariota dalam hal DNA stabil dan bereplikasi dengan sel inang.

Episom sitoplasma virus (seperti pada infeksi poxvirus) juga dapat terjadi.

Beberapa episom, seperti virus herpes, bereplikasi dalam mekanisme lingkaran, mirip dengan virus bakteri fag. Lainnya bereplikasi melalui mekanisme replikasi dua arah (plasmid mirip ta).

Dalam kedua kasus, episom tetap terpisah secara fisik dari kromosom sel inang.

Beberapa virus kanker, termasuk virus Epstein-Barr dan virus herpes terkait sarkoma Kaposi, tetap sebagai episom yang berbeda secara kromosom dalam sel kanker, di mana virus mengekspresikan onkogen yang mendorong proliferasi sel kanker.

Pada kanker, episom ini secara pasif bereplikasi bersama dengan kromosom inang ketika sel membelah.

Ketika episom virus ini memulai replikasi litik untuk menghasilkan beberapa partikel virus, mereka umumnya mengaktifkan mekanisme pertahanan imunitas seluler bawaan yang membunuh sel inang.

Pemeliharaan plasmid

Beberapa plasmid atau inang mikroba termasuk sistem adiksi atau sistem postsegregational killing (PSK), seperti sistem hok/sok (pembunuhan/penekan) plasmid R1 pada Escherichia coli.

Varian ini menghasilkan racun yang tahan lama dan penawar yang berumur pendek.

Berbagai jenis sistem kecanduan plasmid (toksin / antitoksin, berbasis metabolisme, sistem ORT) telah dijelaskan dalam literatur dan digunakan dalam aplikasi bioteknik (fermentasi) atau biomedis (terapi vaksin).

Akhirnya, produktivitas secara keseluruhan dapat ditingkatkan.

Sebaliknya, hampir semua plasmid yang digunakan secara bioteknologi (seperti pUC18, pBR322, dan vektor turunan) tidak mengandung sistem kecanduan toksin dan antitoksin dan oleh karena itu harus disimpan di bawah tekanan antibiotik untuk menghindari hilangnya plasmid.

Plasmid ragi

Ragi secara alami menampung berbagai plasmid.

Yang menonjol di antaranya adalah plasmid 2 m (plasmid melingkar kecil yang sering digunakan untuk rekayasa genetika ragi) dan plasmid pGKL linier dari Kluyveromyces lactis, yang bertanggung jawab atas fenotipe pembunuh.

Jenis plasmid lain sering dikaitkan dengan vektor kloning ragi termasuk:

Yeast Integrating Plasmid (YIp), vektor ragi yang bergantung pada integrasi ke dalam kromosom inang untuk kelangsungan hidup dan replikasi, dan umumnya digunakan ketika mempelajari fungsi gen tunggal atau ketika gen tersebut beracun.

Ini juga terkait dengan gen URA3, yang mengkodekan enzim yang terkait dengan biosintesis nukleotida pirimidin (T, C).

Plasmid Replikasi Ragi (YRp), yang membawa urutan DNA kromosom yang mencakup asal replikasi. Plasmid ini kurang stabil, karena dapat hilang selama tunas.

Ekstraksi DNA plasmid

Seperti disebutkan di atas, plasmid sering digunakan untuk memurnikan urutan tertentu, karena mereka dapat dengan mudah dimurnikan dari sisa genom.

Ada beberapa metode untuk mengisolasi DNA plasmid dari bakteri, yang arketipenya adalah miniprep dan maxiprep/bulkprep.

Yang pertama dapat digunakan untuk dengan cepat menemukan apakah plasmid itu benar di salah satu dari beberapa klon bakteri.

Hasilnya adalah sejumlah kecil DNA plasmid tidak murni, yang cukup untuk analisis cerna restriksi dan untuk beberapa teknik kloning.

Dalam yang terakhir, volume suspensi bakteri yang jauh lebih besar dihasilkan dari mana persiapan maksimal dapat dilakukan. Intinya, ini adalah persiapan mini dalam skala besar yang diikuti dengan pemurnian tambahan.

Ini menghasilkan DNA plasmid yang sangat murni dalam jumlah yang relatif besar (beberapa ratus mikrogram).

konformasi

DNA sirkular terbuka yang terpotong memiliki potongan untai.

DNA sirkular yang direlaksasi benar-benar utuh dengan kedua untai tidak dipotong, tetapi telah direlaksasi secara enzimatis (supercooling dihilangkan).

Ini dapat dicaralkan dengan membiarkan kabel ekstensi yang dipilin terlepas dan rileks dan kemudian pasang ke dirinya sendiri.

DNA superkoil (atau melingkar tertutup secara kovalen) benar-benar utuh dengan kedua untai tidak dipotong, dan dengan putaran integral, menghasilkan bentuk yang kompak. Ini dapat dicaralkan dengan memutar kabel ekstensi dan kemudian mencolokkannya ke dirinya sendiri.

DNA terdenaturasi superkoil seperti DNA superkoil, tetapi memiliki daerah tidak berpasangan yang membuatnya sedikit kurang kompak; ini mungkin hasil dari alkalinitas yang berlebihan selama persiapan plasmid.

Tingkat migrasi untuk fragmen linier kecil berbanding lurus dengan tegangan yang diterapkan pada tegangan rendah.

Pada tegangan yang lebih tinggi, fragmen yang lebih besar bermigrasi dengan kecepatan yang terus meningkat tetapi berbeda. Oleh karena itu, resolusi gel menurun dengan meningkatnya tegangan.

Pada tegangan rendah yang ditentukan, laju migrasi fragmen DNA linier kecil adalah fungsi dari panjangnya.

Fragmen linier besar (lebih dari 20 kb atau kurang) bermigrasi dengan kecepatan tetap tertentu terlepas dari panjangnya.

Ini karena molekul “menghormati”, dan sebagian besar molekul mengikuti ujung depan melalui matriks gel.

Restriksi digest sering digunakan untuk menganalisis plasmid yang dimurnikan. Enzim-enzim ini secara khusus memecah DNA menjadi sekuens pendek tertentu.

Fragmen linier yang dihasilkan membentuk ‘pita’ setelah elektroforesis gel. Dimungkinkan untuk memurnikan fragmen tertentu dengan memotong pita gel dan melarutkan gel untuk melepaskan fragmen DNA.

Karena konformasinya yang rapat, DNA superkoil bermigrasi lebih cepat melalui gel daripada DNA linier atau sirkular terbuka.

Bioinformatika dan perangkat lunak desain

Penggunaan plasmid sebagai salah satu teknik dalam biologi molekuler didukung oleh software bioinformatika.

Program-program ini merekam urutan DNA vektor plasmid, membantu memprediksi situs pembelahan enzim restriksi, dan merencanakan manipulasi.

Contoh paket perangkat lunak yang menangani peta plasmid adalah ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI, dan WebDSV.

Perangkat lunak ini membantu untuk melakukan eksperimen penuh in silico sebelum melakukan eksperimen basah.

Koleksi plasmid

Banyak plasmid telah dibuat selama bertahun-tahun, dan para peneliti telah mengirimkan plasmid ke database plasmid, seperti organisasi nirlaba Addgene dan BCCM / LMBP.

Seseorang dapat menemukan dan meminta plasmid dari database tersebut untuk penelitian lebih lanjut.

Peneliti juga biasanya mengunggah urutan plasmid ke database National Center for Biotechnology Information (NCBI). Menggunakan Pusat Nasional Bioteknologi, urutan database plasmid tertentu dapat dicari.